Un spectrophotomètre permet d'effectuer des mesures d'absorbance A dans la gamme de longueur d'onde \lambda pouvant s'étendre sur l'ensemble du domaine de la lumière visible, voire davantage selon les appareils.

Sur la plupart des spectrophotomètres, le compartiment de mesure se trouve sous un capot permettant de réaliser des mesures en s'affranchissant de la lumière extérieure. La lumière émise par l'appareil, à la longueur d'onde de travail, passe à travers une cuve de mesure transparente dans laquelle se trouve la solution dont on souhaite mesurer l'absorbance A.

❯ Verser la solution à analyser dans une cuve. Attention, il ne faut pas mettre les doigts sur les faces transparentes des cuves. Des traces laissées sur ces faces risqueraient de fausser les mesures et de dévier une partie des rayons par réfraction ou réflexion.

❯ Préparer une seconde cuve avec cette fois‑ci uniquement du solvant.

❯ Paramétrer l'appareil afin qu'il réalise les mesures à la longueur d'onde de travail \lambda.

❯ Faire le blanc en remettant à zéro l'absorbance en plaçant la cuve remplie d'eau dans l'emplacement adéquat.

❯ Remplacer la cuve d'eau par celle de l'échantillon en vérifiant bien l'appui et la verticalité de la cuve.

❯ Si on change la solution dans une cuve, la rincer avec la nouvelle solution pour éviter des effets de dilution et de surconcentration.

La longueur d'onde de travail d'un spectrophotomètre doit respecter plusieurs contraintes. Pour améliorer la sensibilité de l'appareil, il est nécessaire de choisir une longueur d'onde de travail pour laquelle l'absorbance mesurée est élevée. D'autre part, pour améliorer sa précision, l'absorbance autour de la longueur d'onde \lambda choisie doit être relativement stable.

Ces deux contraintes imposent de choisir une longueur d'onde correspond à un maximum local du spectre d'absorption de la solution.


Sur le spectre d'absorption du bleu patenté, on constate qu'un maximum d'absorption se situe à 640 nm. Cette longueur d'onde correspond donc à un choix adéquat pour des mesures d'absorbance au spectrophotomètre.

La loi de Beer‑Lambert est une loi empirique liant l'absorbance d'une solution due à une espèce chimique, notée A, à partir de la concentration \left[\mathrm{X}_{i}\right] de cette espèce.

Sur la plupart des spectrophotomètres, le compartiment de mesure se trouve sous un capot permettant de réaliser des mesures en s'affranchissant de la lumière extérieure. La lumière émise par l'appareil, à la longueur d'onde de travail, passe à travers une cuve de mesure transparente dans laquelle se trouve la solution dont on souhaite mesurer l'absorbance A.

A=\sum_{i}^{n} \epsilon_{i} \cdot l \cdot\left[\mathrm{X}_{i}\right]

A : absorbance de la solution
\epsilon_{i} : coefficient d'absorption molaire à la longueur d'onde \lambda associée à l'espèce chimique \mathrm{X}_{\mathrm{i}} \text{(aq)} (L·mol^-1·cm^-1)
l : longueur de la cuve (cm)
\left[\mathrm{X}_{i}\right] : concentration de l'espèce chimique colorée \mathrm{X}_{\mathrm{i}} \text{(aq)} (mol·L^-1)